Prueba de endotoxinas bacterianas (LAL)

Establecer el procedimiento para la determinación de endotoxinas bacterianas en productos parenterales y agua para inyección usando el reactivo de Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL).

Alcance

Aplica a: productos inyectables, soluciones oftálmicas, agua para inyección (WFI), soluciones de enjuague final de equipos en contacto con estériles, y materias primas donde se requiera control de endotoxinas.

Responsabilidades

Analista de microbiología

Ejecutar la prueba LAL, registrar datos y calcular los resultados.

Jefe de Microbiología

Revisar resultados, mantener la validación del método y gestionar excursiones.

Procedimiento

Cálculo del límite de endotoxinas

Aplicar la fórmula: Límite = K/M, donde K = dosis umbral de pirógeno (5 EU/kg para vía IV) y M = dosis máxima por kg de peso corporal por hora. Para WFI: ≤0.25 EU/mL.

Selección del método

Métodos disponibles: Gel-clot (semicuantitativo, detecta presencia/ausencia a una sensibilidad definida), Turbidimétrico cinético (cuantitativo, mide turbidez vs tiempo), Cromogénico cinético (cuantitativo, mide color). Seleccionar según validación.

Preparación de materiales

Usar material apirogénico (despirogenizado a ≥250°C durante ≥30 minutos). Preparar agua LAL (agua apirogénica, ≤0.005 EU/mL). Reconstituir el reactivo LAL y la endotoxina estándar de control (CSE) según las instrucciones del fabricante.

Validación del ensayo

Cada sesión incluye: curva estándar con endotoxina de referencia, control positivo del producto (muestra + endotoxina spike), control negativo (agua LAL). El spike debe recuperarse entre 50-200% para confirmar que el producto no interfiere.

Ejecución

Para gel-clot: mezclar muestra + reactivo LAL, incubar a 37°C ± 1°C durante 60 ± 2 minutos, invertir el tubo 180° y observar si se forma gel firme. Para cinéticos: cargar placa de microtitulación en lector a 37°C, iniciar lectura automática.

Interpretación de resultados

Gel-clot: gel firme = positivo (endotoxinas ≥ sensibilidad del reactivo). Cinéticos: interpolar contra la curva estándar para obtener el valor en EU/mL. Comparar contra el límite de especificación del producto.

Acciones ante resultado positivo

Si el producto excede el límite: no liberar, investigar fuente de contaminación (agua de proceso, contenedores, materia prima), revisar registros de producción, evaluar si otros lotes están afectados. Documentar y abrir desviación.

Referencias normativas

USP <85>Ph. Eur. 2.6.14FDA Guidance: Pyrogen and Endotoxins TestingOMS TRS 961 Anexo 6

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